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免疫金银染色(IGSS)操作流程

一、基本原理

    免胶体金检测技术是用金属离子和金属蛋白复合物应用免疫组化原理检测组织内抗原抗体的技术,常用胶体金(铁、汞等)重金属离子。由于胶体金容易制成各种大小的颗粒且有很高的电子密度及分辨率,又不影响抗体的活性,因此既可用于免疫组化又适于免疫电镜技术

  • 操作步骤

1、石蜡切片IGSS

  (1)切片脱蜡至水。

    (2)0.1%胰蛋白酶37℃消化20min或抗原修复20min(98℃),自然冷却至室温。

    (3)0.05mol/L(pH7.4)TBS洗3×3min。

    (4)l%EA(卵蛋白)15min,不洗。

    (5)适当稀释的特异抗体室温4h或4℃孵育20h,或37℃孵育1h。

    (6)0.05m01/L(pH7.4)TBS洗3×5min。

    (7)0.02m01/L(pH7.4)TBS(内含0.1%BSA)洗10min。

    (8)1%EA 15min,不洗,1:10~1:20稀释的PAGlonm室温孵育1h,或37℃孵育30min。

    (9)0.05mol/L(pH7.4)TBS洗10min。

    (10)1%戊二醛洗10min。

    (11)双蒸水洗5min。

    (12)1%明胶洗5min。

    (13)银避光显影8~15min。

    (14)双蒸水洗15min。

    (15)固定:用显影定影液(1:4或1:10)固定5min,也可以用15%硫酸钠-20%硫代硫酸钠混合液固定1~3min,或用1%戊二醛固定5min,50℃温水洗3~6min。

    (16)衬染,核固红衬染3min或甲基绿衬染3min。

    (17)常规脱水,二甲苯透明,常规树胶封片。

    (18)镜检:阳性物质呈黑色或黑褐色,颗粒分布于抗原—抗体反应部位;背景较干净,呈红色。

2、冰冻切片IGSS

     做冰冻切片的组织可先经过固定再作切片,也可先制作冰冻切片,然后再固定。这要根据保存抗原的需要而定,固定过的组织可用含20%蔗糖的PBS(0.1mol/L,pH7.4)浸泡过夜,使切片减少冰结晶,保持组织细胞良好的形态结构。切片人0.05mol/L(pH7.4)TBS洗3×3min,染色步骤同石蜡切片。

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